Щоб уникнути помилок у визначенні желточной реакції, необхідно мати на увазі, що іноді спостерігається помутніння середовища без райдужного ободка, у цьому випадку проба на лецитовителлазу вважається негативною. Якщо ж колонії, що виросли на ЖСА, не дають лецитовителлазной реакції, тобто не оточені райдужним віночком, але є ріст стафілококів, то їх теж уважають підозрілими й також отвивают не менш двох з кожного такого посіву на чашки із простим живильним агаром плямами діаметром 5—10 мм. Після добового инкубирования при 37° С отримані макроколонії перевіряють у реакції плазмоагглютинации, для чого мікробну масу розмішують петлею на склі в краплях цитратной кролячої або людської плазми, розведеної 1:4. Утворення пластівців ураховують протягом 30 з-с-1 мін. При наявності плазмоагглютинации такі штами вважають підозрілими й отвивают на скошений агар для подальшого вивчення в коагулазной реакції. При такому доборі число штамів патогенних стафілококів, що пропускаються, людського походження невелико, культури ж, виділені від тварин, потрібно перевіряти в реакції плазмокоагуляции.

Коагулазная проба є основною ознакою, що визначає хвороботворність стафілококів, тому її постановка вимагає до себе максимальної уваги. Для виявлення коагулазной активності в стафілококів, виділених від людей, можна користуватися як цільною кров’ю, так і плазмою кроликів або людини. Можна використовувати також кров або плазму, узяту безпосередньо від людини. Консервована плазма або кров, використовувані для переливання, непридатні для реакції, тому що до них часто додаються консерванти, які перешкоджають життєдіяльності стафілококів, прояву коагулазной активності. Не слід застосовувати кров тварин або людей, що переносять стафилококковие захворювання, особливо затяжні, тому що вона може виявитися нестерильної й містити антикоагулазу. При роботі зі стафілококами, виділеними від рогатої худоби, можна користуватися бичачою кров’ю.

Асептично взяту кров стабілізують за допомогою 1-4% цитрату або 0,1% оксалату. Для одержання плазми нітратну кров центрифугують або відстоюють на холоді. Але, як уже говорилося, можна користуватися й цільною кров’ю. Потім кров розводять стерильним фізіологічним розчином у співвідношенні 1:3 або 1:5 і розливають по 0,2-0,3 мол у стерильні пробірки, які перед стерилізацією повинні бути ретельно вимиті, тому що залишки хімічних речовин можуть впливати на результат плазмокоагуляции.

Випробувані агарові культури стафілококів вносять петлею в плазму й добре перемішують. Бульйонні культури вносять піпеткою в обсязі 0,1 мол У кожному досвіді необхідно ставити контроль із культурами свідомо патогенних стафілококів, що дають коагулазную реакцію, і штамами коагулазоотрицательних мікроорганізмів. Крім того, частина пробірок з розлитою плазмою варто залишати не засіяної мікробами й витримувати в термостаті протягом усього строку досвіду. У випадку настання коагуляції хоча б в одній з них весь досвід потрібно переставити з новою порцією крові. Пробірки з досліджуваними культурами витримують у термостаті при 37 °С у плин доби. Облік результатів проводиться обов’язково двічі: через 2-3 год і 24 ч. Ураховують згортання плазми й утворення згустків. Звичайно культури, активно продуцирующие коагулазу, дають позитивну реакцію вже через 2-3 ч. а якщо вони володіють і вираженої фибринолитической активністю, те спочатку, що утворилися згустки, можуть піддатися розплавлюванню до кінця доби. Слабокоагулирующие штами можуть давати позитивну реакцію в пізній термін-до кінця доби. Досвіди, що дали сумнівний результат, необхідно повторити.

Деякі дослідники, одержавши негативний або сумнівний результат, залишають пробірки на столі. Цього робити не можна, тому що згортання плазми в більше пізній термін може носити не специфічний характер і його не слід приймати в увагу.

Стафілококи, що дають позитивну коагулазную пробу, повинні розглядатися як потенційно патогенні, незалежно від наявності або відсутності в них гемолитических властивостей і характеру пігменту, їх відносять до виду St. aureus і надалі піддають фаготипизации й перевірці на чутливість до антибіотиків.

Поглиблене вивчання стафілококів показало, що основна ознака патогенності - коагулазная реакція може піддаватися мінливості при впливі різних факторів (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падеріна, 1966) , тому в ряді випадків, при виділенні коагулазонегативних стафілококів у монокультурі з патологічних вогнищ, доцільно вивчити в них інші ознаки потенційної хвороботворності й насамперед - здатність ферментувати маннит в анаеробних умовах. Відомо, що серед коагулазоотрицательних частина культур має здатність розщеплювати маннит в анаеробних умовах (8,4% - по даним А. А. Акатова й М. Л. Хатеневер, 1974) .

Визначення ферментації маннита в анаеробних умовах технічно дуже просто й здійснюється шляхом посіву уколом досліджуваних культур у пробірки з високим стовпчиком напіврідкого агару Хоттннгера, що містить 1% маннита й 0,004% індикатора бромкрезолпурпура або бромтимолблау (рН == 7,2) . Це середовище перед посівом “регенерують” , тобто кип’ятять у водяній лазні, швидко прохолоджують, а після посіву заливають шаром стерильного вазелінового масла. Посіви инкубируют при 37 °С у плин 5 днів. Однак у значному числі випадків результати можуть бути враховані вже через добу.

Поряд з реакцією плазмокоагуляции, велике значення придбала ще одна важлива здатність стафілококів, що характеризує їхній потенційну патогенність, - дезоксирибонуклеазная активність. Багато дослідників повідомляють про високу кореляцію цієї ознаки з коагулазной активністю й токсигенностью досліджуваних культур; відзначають, що стафілококи, виділені з патологічного матеріалу, як правило, мають Днк^-азу. Коагула-Зопозитивние штами, отримані від носіїв, можуть не мати цього ферменту, і звичайна відсутність дезоксирибонуклеазной активності сполучається з низькою біохімічною здатністю й атоксигенностью таких культур стафілококів.

За спостереженнями деяких дослідників, серед коагулазонегативних штамів стафілококів, але обладавших іншими ознаками патогенності, виділених у ряді випадків від хворих з різними гнійними інфекціями, дезоксирибонуклеазную активність проявляли від 10 до 29% таких культур (И. И. Панишева й сотр., 1967; Franklin і соавт., 1966; Lierd і Golde, 1970) .

У цей час цей тест може служити надійною диференціальною ознакою між патогенними й непатогенними стафілококами й у той же час може допомогти в диференціації ступеня патогенності коагулазопозитивних штамів і, безумовно, приверне увагу до коагулазонегативним, але ферментом, що володіє цим, культурам стафілококів і в ряді випадків дозволить віднести останні до хвороботворних форм із більшою впевненістю.

Методика визначення дезоксирибонуклеазной активності нескладна, в основу її покладений метод Джеффриса. Готовлять взапас 2% МПА (рН—8,6) , що містить ДНК (2 мг/мол середовища) , розливають по флаконах і стерилізують текучою парою протягом 30 хв. Перед розливом у чашки до середовища додають CaCIa (0,8 мг/мол) . На підсушене середовище засівають добові культури стафілококів. Після інкубації протягом 18—20 год при 37°, на поверхню середовища наливають IN розчин НС1 і через 7—10 хв ураховують зони просвітління, які оцінюють хрестами (Н. Б. Мордвинова й соавт., 1967) .

Нами запропонований більше економічний метод для виявлення Днк-ази в мікроорганізмів. Цей спосіб, крім зменшення в 2 рази витрати ДНК на кожний досвід, дозволяє використовувати більше дешеву низкополимерную нуклеиновую кислоту, виготовлену Олайнским заводом хімічних реактивів. Пропонована методика широко апробована на кафедрі мікробіології ЛСГМИ й по якості результатів не уступає загальноприйнятої. Тому ми приводимо її докладний опис.

Для готування робочого розчину ДНК, навішення нуклеиновой кислоти з розрахунку 10 мг/мол поміщають у дистильовану воду, додають 0,5 мол 0,2% (або 0,8%) розчину NaOH на кожні 10 мол води. Для кращого розчинення ДНК суміш або нагрівають до кипіння у водяній лазні при постійному перемішуванні скляною паличкою, або залишають на ніч при 37 °С у термостаті. До розплавленого й охолодженому до 50 °С МПА додають робочий розчин ДНК із розрахунку 1 мг/мол (на 9 мол МПА—1 мол розчину ДНК) , перемішують, розливають по10л(л у пробірки, стерилізують текучою парою протягом 30 хв або в автоклаві при 0,5 атмосфери протягом 20 хв. Строк зберігання - 1-2 мес.

При постановці досвіду стовпчики агару із ДНК розтоплюють, у водяній лазні додають 0,1 мол официнального стерильного 10% р-ра Сась, перемішують і виливають на шар добре підсушеного живильного агару в чашки Петри й знову підсушують. Добову агарову культуру засівають маленькими бляшками (діаметр дорівнює 2-2,5 мм) або штампом-репликатором не більше 20-25 бляшок, щоб уникнути злиття зон деполимеризации ДНК. Після 18- 20-годинної інкубації поверхня агару заливають 5 мол IN розчину НС1 і через 3-5 хв ураховують зони просвітління. Реакції оцінюють у хрестах.

Pages: 1 2 3